?背景技術(shù):

白血病是一種造血系統(tǒng)惡性增殖性疾病,通常指因白血病細(xì)胞大量增殖、累積所引起的一類疾病。由于白血病分型和預(yù)后分層的復(fù)雜性,所以為了獲得更好的治療效力,對(duì)白血病的研究勢(shì)在必行。然而,體外培養(yǎng)的白血病細(xì)胞的生物學(xué)特征與體內(nèi)的白血病細(xì)胞生物學(xué)特征通常存在一定的差異,且在人體上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)會(huì)導(dǎo)致極高的成本和風(fēng)險(xiǎn),所以,其對(duì)應(yīng)的動(dòng)物模型是對(duì)白血病深入研究的重要環(huán)節(jié)。

小鼠是白血病研究中常用的理想動(dòng)物模型,人類血液系統(tǒng)的髓系、淋巴系等惡性腫瘤均可獲得相應(yīng)的小鼠模型,但是現(xiàn)有的人源化小鼠模型依然存在構(gòu)建成功率低、臨床相關(guān)性不高等缺陷。

?技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:

本技術(shù)提供了白血病疾病模型、其構(gòu)建方法以及通過(guò)該模型對(duì)候選藥物效力進(jìn)行評(píng)估的方法和系統(tǒng)。疾病模型構(gòu)建方法直接建立患者來(lái)源的移植瘤疾病模型,具有很高的成功率,此方法建立的疾病模型具有很高的臨床相關(guān)性。

制備白血病人源化疾病模型的方法:

a)將來(lái)自白血病患者的骨髓樣本制備為細(xì)胞懸液,并使用單核細(xì)胞分離液來(lái)對(duì)所述細(xì)胞懸液進(jìn)行離心分離;

b)獲取包含白血病細(xì)胞的細(xì)胞層并制備白血病細(xì)胞懸液;

c)判斷所述白血病是否為T(mén)細(xì)胞型白血病;

對(duì)于非T細(xì)胞型白血病,去除由b)獲得的所述白血病細(xì)胞懸液中的T細(xì)胞,得到待接種的白血病細(xì)胞懸液,并使所述待接種的白血病細(xì)胞懸液中白血病細(xì)胞的終密度為2x107/ml至5x107/ml;

對(duì)于T細(xì)胞型白血病,從由b)獲得的所述白血病細(xì)胞懸液制備待接種的白血病細(xì)胞懸液,其中白血病細(xì)胞的終密度為2x107/ml至5x107/ml;

d)根據(jù)所述患者的白血病類型選擇適當(dāng)?shù)拿庖呷毕菪托∈?并對(duì)所述免疫缺陷型小鼠進(jìn)行放射性處理;

e)將由c)獲得的所述待接種的白血病細(xì)胞懸液注射接種到d)所述經(jīng)放射性處理的免疫缺陷型小鼠中。

在某些實(shí)施方式中,所述患者骨髓樣本中白血病細(xì)胞的含量為至少90%。

在某些實(shí)施方式中,所述單核細(xì)胞分離液為Ficoll,且所述離心分離為密度梯度離心分離。

在某些實(shí)施方式中,使用RPMI細(xì)胞培養(yǎng)基制備白血病細(xì)胞懸液。

在某些實(shí)施方式中,被去除的所述T細(xì)胞為CD3陽(yáng)性T細(xì)胞。例如,可通過(guò)使用包含CD3抗體的磁珠來(lái)去除所述CD3陽(yáng)性T細(xì)胞。

在某些實(shí)施方式中,可使用高磁場(chǎng)來(lái)去除所述CD3陽(yáng)性T細(xì)胞。

在某些實(shí)施方式中,所述白血病類型為急性淋巴細(xì)胞性白血病,且所述免疫缺陷型小鼠為NSG小鼠。對(duì)于該NSG小鼠,所述放射性處理為X射線輻射,且輻射劑量為200cGy至300cGy。

在某些實(shí)施方式中,所述白血病類型為急性髓性白血病,且所述免疫缺陷型小鼠為MISTRG小鼠。對(duì)于該MISTRG小鼠,所述放射性處理為X射線輻射,且輻射劑量為550cGy至650cGy。

在某些實(shí)施方式中,在注射所述白血病細(xì)胞懸液之前的12-24小時(shí)內(nèi)對(duì)所述免疫缺陷型小鼠進(jìn)行所述放射性處理。

在某些實(shí)施方式中,所述免疫缺陷型小鼠的年齡為5-7周。

在某些實(shí)施方式中,在注射接種所述基本不含T細(xì)胞的白血病細(xì)胞懸液之前對(duì)所述免疫缺陷型小鼠進(jìn)行紅外燈照射及加熱。

在某些實(shí)施方式中,所述方法還包括監(jiān)測(cè)來(lái)自所述患者的白血病細(xì)胞在所述小鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)情況。例如,可通過(guò)監(jiān)測(cè)經(jīng)注射接種的所述小鼠外周血中huCD45+、huCD19+、huCD3+、和/或huCD33+細(xì)胞的比例來(lái)監(jiān)測(cè)來(lái)自所述患者的白血病細(xì)胞在所述小鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)情況。

在某些實(shí)施方式中,所述方法進(jìn)一步包括:

g)當(dāng)經(jīng)注射接種的所述小鼠外周血中huCD45+、huCD19+、huCD3+、和/或huCD33+細(xì)胞的比例至少為50%時(shí),分離所述小鼠的脾臟,使其破碎,并使經(jīng)破碎的所述脾臟的細(xì)胞懸浮于細(xì)胞培養(yǎng)基中,以獲得來(lái)自所述脾臟的細(xì)胞懸液;

h)使用單核細(xì)胞分離液來(lái)對(duì)所述來(lái)自脾臟的細(xì)胞懸液進(jìn)行離心分離;

i)獲取包含白血病細(xì)胞的細(xì)胞層,使該細(xì)胞層中的細(xì)胞懸浮于含有10%DMSO的胎牛血清中,以制備細(xì)胞終密度為2x107/ml至5x107/ml的儲(chǔ)備液;以及

j)將由i)獲得的所述儲(chǔ)備液冷凍儲(chǔ)存在液氮中備用。

另一方面,涉及一種白血病人源化疾病模型,所述的用于制備白血病人源化疾病模型的方法制備。

在一個(gè)方面,涉及一種白血病藥物篩選方法,該方法包括:

a)獲取本申請(qǐng)所述的白血病人源化疾病模型;

b)監(jiān)測(cè)所述白血病人源化疾病模型的外周血中huCD45+、huCD19+、huCD3+、和/或huCD33+細(xì)胞的比例,當(dāng)該比例達(dá)到1%-5%時(shí),向所述模型施用候選藥物;

c)施用所述候選藥物后,繼續(xù)監(jiān)測(cè)所述huCD45+、huCD19+、huCD3+、和/或huCD33+細(xì)胞在所述模型外周血細(xì)胞中所占比例的變化,以評(píng)估該候選藥物的效力。

在某些實(shí)施方式中,施用所述候選藥物后,當(dāng)所述huCD45+、huCD19+、huCD3+、和/或huCD33+細(xì)胞在所述模型外周血細(xì)胞中所占比例保持低于1%,并維持該比例至少2周時(shí),判定所述候選藥物有效。

在某些實(shí)施方式中,所述候選藥物選自下組中的一種或多種:長(zhǎng)春新堿、氨甲葉酸、地塞米松、阿霉素、左旋門(mén)冬酰胺、拓?fù)涮婵?、氯法拉濱、卡非佐米、替西羅莫司、達(dá)沙替尼、硼替佐米、SAR3419、全反式維甲酸、SAHA、舒尼替尼、環(huán)磷酰胺和維甲酰酚胺。

例如,所述候選藥物可包括長(zhǎng)春新堿,且以如下方式向所述模型施用所述長(zhǎng)春新堿:通過(guò)腹腔注射施用,每次施用量為0.5mg/kg,每周施用一次且持續(xù)施用3-6周。

例如,所述候選藥物可包括氨甲葉酸,且以如下方式向所述模型施用所述氨甲葉酸:通過(guò)腹腔注射施用,每次施用量為3-6mg/kg,每日施用一次,隔周施用且持續(xù)施用6-10周。

例如,所述候選藥物可包括地塞米松,且以如下方式向所述模型施用所述地塞米松:通過(guò)腹腔注射施用,每次施用量為10-20mg/kg,每日施用一次且持續(xù)施用3-6周。

例如,所述候選藥物可包括阿霉素,且以如下方式向所述模型施用所述阿霉素:通過(guò)靜脈注射施用,每次施用量為0.5-3mg/kg,每周施用一次且持續(xù)施用3-6周。

例如,所述候選藥物可包括左旋門(mén)冬酰胺,且以如下方式向所述模型施用所述左旋門(mén)冬酰胺:通過(guò)腹腔注射施用,每次施用量為500-2000KU/kg,每日施用一次且持續(xù)施用3-6周。

在某些實(shí)施方式中,所述候選藥物包括拓?fù)涮婵?且以如下方式向所述模型施用所述拓?fù)涮婵?通過(guò)腹腔注射施用,每次施用量為0.1-5mg/kg,每日施用一次且持續(xù)施用2-8周,給藥兩周后停藥一周。

在某些實(shí)施方式中,所述候選藥物包括氯法拉濱,且以如下方式向所述模型施用所述氯法拉濱:通過(guò)腹腔注射施用,每次施用量為10-100mg/kg,每日施用一次且持續(xù)施用3-6周。

在某些實(shí)施方式中,所述候選藥物包括卡非佐米,且以如下方式向所述模型施用所述卡非佐米:通過(guò)靜脈注射施用,每次施用量為0.1-10mg/kg,每周施用二次且持續(xù)施用3-6周。

在某些實(shí)施方式中,所述候選藥物包括替西羅莫司,且以如下方式向所述模型施用所述替西羅莫司:通過(guò)腹腔注射施用,每次施用量為5-50mg/kg,每日施用一次且持續(xù)施用1-3周。

在某些實(shí)施方式中,所述候選藥物包括達(dá)沙替尼,且以如下方式向所述模型施用所述達(dá)沙替尼:通過(guò)口服施用,每次施用量為5-50mg/kg,每日施用一次且持續(xù)施用2-6周。

在某些實(shí)施方式中,所述候選藥物包括硼替佐米,且以如下方式向所述模型施用所述硼替佐米:通過(guò)腹腔注射施用,每次施用量為0.1-20mg/kg,每周施用二次且持續(xù)施用4-8周。

在某些實(shí)施方式中,所述候選藥物包括SAR3419,且以如下方式向所述模型施用所述SAR3419:通過(guò)腹腔注射施用,每次施用量為0.5-50mg/kg,每周施用一次且持續(xù)施用4-8周。

在某些實(shí)施方式中,所述候選藥物包括全反式維甲酸,且以如下方式向所述模型施用所述全反式維甲酸:通過(guò)腹腔注射施用,每次施用量為0.5-10mg/kg,每周施用一次且持續(xù)施用2-6周。

在某些實(shí)施方式中,所述候選藥物包括SAHA,且以如下方式向所述模型施用所述SAHA:通過(guò)腹腔注射施用,每次施用量為100-500mg/kg,每日施用一次且持續(xù)施用3-6周。

在某些實(shí)施方式中,所述候選藥物包括舒尼替尼,且以如下方式向所述模型施用所述舒尼替尼:通過(guò)口服施用,每次施用量為10-100mg/kg,每日施用一次且持續(xù)施用2-6周。

在某些實(shí)施方式中,所述候選藥物包括環(huán)磷酰胺,且以如下方式向所述模型施用所述環(huán)磷酰胺:通過(guò)腹腔注射施用,每次施用量為30-300mg/kg,每日施用一次且持續(xù)施用2-6周。

在某些實(shí)施方式中,所述候選藥物包括維甲酰酚胺,且以如下方式向所述模型施用所述維甲酰酚胺:通過(guò)腹腔注射施用,每次施用量為20-200mg/kg,每日施用一次且持續(xù)施用2-6周。

在一個(gè)方面,本申請(qǐng)涉及一種白血病藥物篩選系統(tǒng),該系統(tǒng)包括本申請(qǐng)所述的白血病人源化疾病模型。

在某些實(shí)施方式中,該系統(tǒng)還包括一種或多種候選藥物。所述候選藥物可選自下組中的一種或多種:長(zhǎng)春新堿、氨甲葉酸、地塞米松、阿霉素、左旋門(mén)冬酰胺、拓?fù)涮婵?、氯法拉濱、卡非佐米、替西羅莫司、達(dá)沙替尼、硼替佐米、SAR3419、全反式維甲酸、SAHA、舒尼替尼、環(huán)磷酰胺和維甲酰酚胺。

例如,所述候選藥物可包括長(zhǎng)春新堿,且所述長(zhǎng)春新堿適于根據(jù)如下要求施用于所述白血病人源化疾病模型:適于通過(guò)腹腔注射施用,每次施用量為0.5mg/kg,每周施用一次且持續(xù)施用3-6周。

例如,所述候選藥物可包括氨甲葉酸,且所述氨甲葉酸適于根據(jù)如下要求施用于所述白血病人源化疾病模型:適于通過(guò)腹腔注射施用,每次施用量為3-6mg/kg,每日施用一次,隔周施用且持續(xù)施用6-10周。

例如,所述候選藥物可包括地塞米松,且所述地塞米松適于根據(jù)如下要求施用于所述白血病人源化疾病模型:適于通過(guò)腹腔注射施用,每次施用量為10-20mg/kg,每日施用一次且持續(xù)施用3-6周。

例如,所述候選藥物可包括阿霉素,且所述阿霉素適于根據(jù)如下要求施用于所述白血病人源化疾病模型:適于通過(guò)靜脈注射施用,每次施用量為0.5-3mg/kg,每周施用一次且持續(xù)施用3-6周。

例如,所述候選藥物可包括左旋門(mén)冬酰胺,且所述左旋門(mén)冬酰胺適于根據(jù)如下要求施用于所述白血病人源化疾病模型:適于通過(guò)腹腔注射施用,每次施用量為500-2000KU/kg,每日施用一次且持續(xù)施用3-6周。

在某些實(shí)施方式中,所述候選藥物包括拓?fù)涮婵?且所述拓?fù)涮婵颠m于根據(jù)如下要求施用于所述白血病人源化疾病模型:適于通過(guò)腹腔注射施用,每次施用量為0.1-5mg/kg,每日施用一次且持續(xù)施用2-8周,給藥兩周后停藥一周。

在某些實(shí)施方式中,所述候選藥物包括氯法拉濱,且所述氯法拉濱適于根據(jù)如下要求施用于所述白血病人源化疾病模型:適于通過(guò)腹腔注射施用,每次施用量為10-100mg/kg,每日施用一次且持續(xù)施用3-6周。

在某些實(shí)施方式中,所述候選藥物包括卡非佐米,且所述卡非佐米適于根據(jù)如下要求施用于所述白血病人源化疾病模型:適于通過(guò)靜脈注射施用,每次施用量為0.1-10mg/kg,每周施用二次且持續(xù)施用3-6周。

在某些實(shí)施方式中,所述候選藥物包括替西羅莫司,且所述替西羅莫司適于根據(jù)如下要求施用于所述白血病人源化疾病模型:適于通過(guò)腹腔注射施用,每次施用量為5-50mg/kg,每日施用一次且持續(xù)施用1-3周。

在某些實(shí)施方式中,所述候選藥物包括達(dá)沙替尼,且所述達(dá)沙替尼適于根據(jù)如下要求施用于所述白血病人源化疾病模型:適于通過(guò)口服施用,每次施用量為5-50mg/kg,每日施用一次且持續(xù)施用2-6周。

在某些實(shí)施方式中,所述候選藥物包括硼替佐米,且所述硼替佐米適于根據(jù)如下要求施用于所述白血病人源化疾病模型:適于通過(guò)腹腔注射施用,每次施用量為0.1-20mg/kg,每周施用二次且持續(xù)施用4-8周。

在某些實(shí)施方式中,所述候選藥物包括SAR3419,且所述SAR3419適于根據(jù)如下要求施用于所述白血病人源化疾病模型:適于通過(guò)腹腔注射施用,每次施用量為0.5-50mg/kg,每周施用一次且持續(xù)施用4-8周。

在某些實(shí)施方式中,所述候選藥物包括全反式維甲酸,且所述全反式維甲酸適于根據(jù)如下要求施用于所述白血病人源化疾病模型:適于通過(guò)腹腔注射施用,每次施用量為0.5-10mg/kg,每周施用一次且持續(xù)施用2-6周。

在某些實(shí)施方式中,所述候選藥物包括SAHA,且所述SAHA適于根據(jù)如下要求施用于所述白血病人源化疾病模型:適于通過(guò)腹腔注射施用,每次施用量為100-500mg/kg,每日施用一次且持續(xù)施用3-6周。

在某些實(shí)施方式中,所述候選藥物包括舒尼替尼,且所述舒尼替尼適于根據(jù)如下要求施用于所述白血病人源化疾病模型:適于通過(guò)口服施用,每次施用量為10-100mg/kg,每日施用一次且持續(xù)施用2-6周。

在某些實(shí)施方式中,所述候選藥物包括環(huán)磷酰胺,且所述環(huán)磷酰胺適于根據(jù)如下要求施用于所述白血病人源化疾病模型:適于通過(guò)腹腔注射施用,每次施用量為30-300mg/kg,每日施用一次且持續(xù)施用2-6周。

在某些實(shí)施方式中,所述候選藥物包括維甲酰酚胺,且所述維甲酰酚胺適于根據(jù)如下要求施用于所述白血病人源化疾病模型:適于通過(guò)腹腔注射施用,每次施用量為20-200mg/kg,每日施用一次且持續(xù)施用2-6周。