雙鏈酶性質(zhì)、用途與生產(chǎn)工藝

化學性質(zhì) 

雙鏈酶系從β溶血性鏈球菌培養(yǎng)液中經(jīng)提取、分離而制得的混合酶制劑，為白色、類白色結(jié)晶性或無定形粉末。易溶于水。但水溶液室溫下迅速失活，2～10⁰C可穩(wěn)定7天，在中性介質(zhì)中有最大的活性。粉末4⁰C以下可維持活性達18個月。鏈激酶能溶解血栓和滲出物的纖維部分，去氧核糖核酸能液壓死細胞的黏稠性核蛋白。兩種酶合用可促使外傷或炎癥后血塊及纖維或化膿性堆積物的清除。

用途 

雙鏈酶可作為輔助藥物用于治療膿胸、血胸、血腫、引流竇的慢性化膿、骨髓炎、潰瘍和感染性創(chuàng)傷。亦用于眼前房出血及玻璃體積血。但是，腔內(nèi)注射可引起發(fā)熱和出血。發(fā)熱可用糖皮質(zhì)激至少治療。出血用6-氨基已酸有效。本品辦是一種輔助治療藥物。只能在抗菌治療和外科清創(chuàng)、引流等基礎上應用。本品禁用于急性化膿性峰窩組織炎、活動性肺結(jié)核及支氣管胸膜瘺病人，以免病灶擴散。低纖維酶原、低纖維蛋白原及肝功能、血象異常者亦均禁用。
本品可于患部腔內(nèi)注射，或局部外用。腔內(nèi)注射，對血胸和膿胸，可用10萬單位SK和5萬單位SD溶于10ml以上生理鹽水注入。對上頜竇積膿，可注射1萬～1.5萬單位的SK和5000～7500單位SD（溶于2～3ml生理鹽水中）?？诤咳?次，每次1 片，連用4～6日，滴用，用1000單位/ml溶液局部滴入，`1～2h1次，局部注射，眼內(nèi)球后或結(jié)膜下注射、病灶周圍注射，濃度為1000～2000單位/ml。

生產(chǎn)方法 

菌種培養(yǎng) 將β溶血性鏈球菌接種于含2%羊血清的牛肉湯菌種培養(yǎng)基5ml中，調(diào)節(jié)pH7.1～7.2,37⁰C培養(yǎng)8h左右。待菌種培養(yǎng)基呈渾濁狀時（否則應延長培養(yǎng)時間），將菌株移植于瓊脂平板上，培養(yǎng)16 ～18h,即為生產(chǎn)用菌株。可保存4⁰C冰箱中，可使用1個月之久。
菌種^{牛肉湯培養(yǎng)基；370;17h}→_{菌種培養(yǎng)}平板菌落
一至三級種子培養(yǎng)將平板菌落接種子5ml種子培養(yǎng)基中，在37⁰C下，培養(yǎng)5～8h即可。接三級種子時，在10L的種子罐中培養(yǎng)，種子量為2%～3%，37⁰C培養(yǎng)10～13h即可得三級種子培養(yǎng)液。
平板菌落^{培養(yǎng)基；370;6h}^→{一級種子培養(yǎng)液一級種子培養(yǎng)液^{培養(yǎng)基；370;6h}^→_{二級種子培養(yǎng)}
二級種子培養(yǎng)液^{培養(yǎng)基；370;11h}^→_{三級種子培養(yǎng)}三級種子培養(yǎng)液
發(fā)酵培養(yǎng)取發(fā)酵培養(yǎng)基150L，接種量為5%～10%，在罐壓19.62kPa(在0.2kg)下，培養(yǎng)溫度降至33⁰左右，每隔半小時用碳酸鈉（3mol/L）調(diào)節(jié)pH，使酸度維持pH7.3～7.4之間，發(fā)酵培養(yǎng)12h左右，進行取樣，測鏈激激酶活性單位，直到鏈激酶活性達高峰時終止發(fā)酵，周期約14～16h，收率為鏈激酶519U/ml，脫氧核糖核酸酶1677U/ml.
三級種子培養(yǎng)液^{培養(yǎng)基}→_{發(fā)酵液}
吸附、洗脫發(fā)酵液用氫氧化鈉溶液（100g/L即10%）調(diào)節(jié)pH7.5～8，隨后在每100ml發(fā)酵液緩緩加入膽固醇乙醇溶液（5%）1ml，充分攪拌5min。再在每100ml發(fā)酵液加入已通過80目以上的724樹脂，待泡沫消失后，用乙酸溶液（10%）調(diào)節(jié)pH4.8～5.不斷攪拌使之吸附30min，靜置15min棄去上清液，樹脂用pH4.8～5的自來水清洗 2次，pH4.8～5蒸餾水清洗 1次，洗凈后過濾抽干，移入容器中，加入少量冰蒸餾水，以能攪拌為宜。在15^0C以下，邊攪拌邊滴加氫氧化鈉（100g/L即10%）直至PH達到7.2為止。布氏漏斗過濾，并以少量蒸餾水沖洗樹脂1次，合并濾液和洗液，得洗脫液。
發(fā)酵液^{膽固醇乙醇液；724樹脂}→_吸附吸附物^{H₂OnaOH;pH7}→_洗脫洗脫液
鹽析每千克洗脫液加入243g的硫酸酸銨，使硫酸銨的飽和度達到40%，隨時用氫氧化鈉（100g/L）調(diào)節(jié)ph7～7.2，在10⁰C左右待硫酸銨全部溶解，離心得[Ⅰ]沉淀物，供制備鏈激酶用；[Ⅱ]母液，供制備脫氧核核糖核酸酶，再分別進行處理。
洗脫液^{(NH₄)₂SO₄;100C}→_鹽析^{→[Ⅰ]沉淀（供制鏈激酶用）}_{→母液[Ⅱ]（供制脫氧核糖核酸酶用）}沉淀物——制備鏈激酶
磷酸鈣處理、沉淀將沉淀物搗碎，加入一定量的蒸餾水并調(diào)節(jié)pH7.2,使其溶解。溶解后用氫氧化鈉（100g/L）調(diào)節(jié)pH8～9，在充分攪拌下，每100ml溶液加入磷酸鈉（152g/L即15.2%）10～17ml（體積為溶液的1/10～1/6），再加入乙酸鈣（226g/L即22.6%）5～8ml，離心，收集澄清液，用鹽酸（10%）調(diào)節(jié)pH7.2,即得酶溶液。將酶液置于0⁰C右左的鹽冰浴中，每100ml酶液中緩緩加入30ml冰甲醇，此時溫度應低于8⁰C，再用鹽酸（10%）調(diào)節(jié)pH至5.2～5.4，靜置15～30min。離心，收集沉淀，得酶的精制品。
[Ⅰ]沉淀^{H₂O;Na₃PO₄;Ca(Ac)₂}→_{磷酸鈣處理}酶溶液^{甲醇；pH5.3}→_沉淀粗制品沉淀
等電點處理、沉淀將粗制品加適量餾水并調(diào)節(jié)pH至7.2。，使之完全溶解。置冰溶中用鹽酸（1mol/L）調(diào)節(jié)ph至5，進行沉淀，收集沉淀，再加入與原液等體積的、pH7.2的蒸餾水中，置冰浴中降溫到0⁰C， 在小于5⁰C條件下，在每100ml冰溶液中，逐漸加入冰甲醇30ml，用鹽酸（1mol/L）調(diào)節(jié)ph為5.4～5.5,靜置15～30min，離心，得沉淀物。
粗制品沉淀^{蒸餾水；pH7.2}→酶粗制液^甲醇;pH5.4→_沉淀沉淀物
預吸附、等電點處理將沉淀溶于pH6.6的蒸餾水中，使酶液濃度給50～100萬單位/ml，加入等量的pH6.6磷酸緩沖液（0.2mol/L）,然后在每3億單位/ml的酶液濃度加入已用ph6.6磷酸沖液平衡過的DEAE-纖維素200g，充分攪拌15min右左，過濾，DEAE-纖維用pH6.6 磷酸緩沖液（0.1mol/L）少量洗滌2次，合并濾液和洗液，用鹽酸（1mol/L）調(diào)節(jié)pH5 沉淀，離心收集鏈激酶沉淀，配制成酶液濃度為50～100U/ml的、pH7.2蒸餾水溶液，得供精制的酶溶液。
沉淀物DEAE-纖維素柱；pH6.6→洗濾液^{HCl;蒸餾水pH5.5→7.2}→酶溶液
吸附、洗脫按每億單位用800g右左的DEAE-纖維素（精制用）計算投料，加適量的pH6.6磷酸緩沖液（0.01mol/L），攪拌均勻，將酶液通過色譜柱進行吸附，完成后，用少量ph6.6磷酸緩沖液（0.01mol/L）洗滌，以ph6.6磷酸緩沖液（0.08mol/L進行洗脫，收集20000U/ml以上的鏈激酶洗脫液。
酶溶液DEAE-

雙鏈酶 上下游產(chǎn)品信息

上游原料

瓊脂粉 鏈激酶 碳酸鈉

下游產(chǎn)品

雙鏈酶 生產(chǎn)廠家

 

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